TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
1. Tóm tắt
– Tên tác giả: Vũ Phương Nhung
– Tên luận án: Nghiên cứu đa hình/đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 cytochrome P450 ở người Kinh Việt Nam.
– Ngành khoa học của Luận án: Công nghệ sinh học
– Mã số: 9 42 02 01
– Tên cơ sở đào tạo: Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Nội dung
2.1. Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án
2.1.1. Mục đích
– Xây dựng cơ sở dữ liệu về đa hình/đột biến của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở người Kinh Việt Nam.
– Xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồng thời phân tích và dự đoán chức năng của các biến thể mới.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Một trăm ba mươi sáu người Kinh khỏe mạnh và không có quan hệ huyết thống tuổi từ 18-35 tình nguyện tham gia vào nghiên cứu (55 nam, 81 nữ). Trong đó, 100 mẫu (40 nam, 60 nữ) được sử dụng để khảo sát đa hình/đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và 136 mẫu được dùng cho khảo sát đa hình/đột biến gen CYP2D6. Nguồn gốc dân tộc của các đối tượng tham gia nghiên cứu được kiểm tra dựa trên những thông tin thu được từ 3 thế hệ, với ít nhất là 3 thế hệ liên tiếp đều là dân tộc Kinh. Nghiên cứu này đã được thông qua bởi hội đồng đạo đức trong y học thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội, Việt Nam.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
– Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng bộ kit ExgeneTM Blood SV mini Kit (GeneAll, Hàn Quốc).
– Xác định nồng độ DNA tổng số: DNA tổng số tách từ mẫu máu được kiểm tra bằng điện di và sau đó nồng độ DNA mạch đôi được kiểm tra bằng bộ kit Qubit dsDNA HS Assay.
– Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5
– Giải trình tự Sanger:
– Phương pháp MLPA: Các CNV của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 được phân tích bằng phương pháp MLPA sử dụng bộ kit thương mại SALSA MLPA P128-C1 Cytochrome P450 Probemix.
– Long range (LR) PCR: Phương pháp này được sử dụng nhằm khuếch đại các đoạn dài và phát hiện allele CYP2D6*5.
– Phân tích số liệu nghiên cứu: Phần mềm Bioedit được sử dụng để phân tích các kết quả giải trình tự từ máy giải trình tự tự động. Trạng thái cân bằng quần thể Hardy-Weinberg của mỗi biến thể được tiến hành thông qua phần mềm HAPLOVIEW. Kiểm định khi bình phương (χ2) và Fisher exact trên Microsoft Excel 2010 được áp dụng để so sánh tần số allele của các gen trong nghiên cứu với các quần thể khác trên thế giới.
– Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới: Chức năng của các biến thể mới được dự đoán sử dụng các công cụ như Polyphen-2, PROVEAN, Splicing Finder và MATCH.
2.3. Các kết quả chính và kết luận
1.Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu đa hình di truyền cho các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 (100 mẫu) và CYP2D6 (136 mẫu) ở người Kinh sử dụng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp và phân tích số bản sao bằng MLPA.
2.Đã xác định được thành phần kiểu gen, tần số allele và các biến thể mới của 4 gen như sau: 3 kiểu gen, 3 allele và 6 biến thể mới của gen CYP2C9; 6 kiểu gen, 4 allele và 3 biến thể mới của gen CYP2C19, 29 kiểu gen, 18 allele và 7 biến thể mới của gen CYP2D6; 3 kiểu gen và 2 allele của gen CYP3A5. Trong đó:
– Gen CYP2C9: KSáu biến thể mới gồm 5 trong intron và 1 trong exon của CYP2C9. Biến thể 42627 C>A (p.Pro363His) thuộc exon 7được dự đoán in silico là gây ảnh hưởng có hại đến chức năng của protein.
– Gen CYP2C19: Các biến thể mới được phát hiện đều nằm trong vùng intron.
– Gen CYP2D6: Bảy biến thể mới bao gồm 3 trong promoter, 2 trong intron và 2 trong exon. Biến thể 3157G>T (p.Arg329Leu) thuộc exon 7 được dự đoán in silico là gây ảnh hưởng có hại đến chức năng của protein. Ngoài ra, biến thể 3851G>A (p.Trp358X) thuộc exon 8 làm xuất hiện mã kết thúc sớm.
