TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
a) Tóm tắt mở đầu:
Tên tác giả: NGUYỄN ĐỨC TIẾN
Tên luận án: Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201
Tên cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
b) Nội dung bản trích yếu:
– Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án:
Phân lập, tuyển chọn
Aspergillus.oryzae (A.oryzae) sinh tổng hợp chất kìm hãm α-glucosidase (AGIs) bằng phương pháp lên men rắn đạt hiệu quả cao. Xác định điều kiện nhân giống và sinh tổng hợp AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. Xác định điều kiện chiết xuất, tinh chế, xác định thành phần hóa học AGIs. Hướng ứng dụng và đề xuất quy trình công nghệ sản xuất AGIs.
– Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng:
+ Phương pháp đếm khuẩn lạc: Xác định số lượng tế bào nấm mốc trong mẫu bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch thạch
+ Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza theo phương pháp của Toomoyuki và cộng sự 1999, xác định khả năng kìm hãm α-glucosidaza (giá trị IC50) theo phương pháp của Jing và cộng sự 2007.
+ Phương pháp xác định hàm lượng protein (%), theo AOAC 991,20; hàm lượng lipit(%), theo AOAC 991,36; Độ ẩm (%) theo TCVN 4326: 2001 (ISO 6496:1999); Phân tích cảm quan bằng phép thử thị hiếu: theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215 – 79;
+ Tuyển chọn dòng nấm có khả năng tổng hợp hoạt chất AGIs cao
+ Định loại A.oryzae theo khóa phân loại Aspergillus của Klich
+ Định danh dòng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1-58S-ITS2
+ Nhận dạng chất AGIs, theo phương pháp Min-Gu-Kang và cộng sự, (2013)
+ Tinh sạch chất AGIs bằng RP- HPLC.
+ Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của chất AGIs bằng khối phổ.
+ Định lượng peptide AGIs bằng RP-HPLC.
+ Thử độc tính cấp chế phẩm theo phương pháp của Đỗ Trung Đàm, (1996).
+ Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lập lại ít nhất 3 lần. Số liệu được xử lý trên phần mềm thống kê Irristat 4.0 và thống kê toán học.
– Các kết quả chính và kết luận:
1. Từ 19 mẫu mốc được lấy ở một số cơ sở sản xuất tương đã phân lập, tuyển chọn và định danh bằng phương pháp giải trình tự gen vùng ITS1 – 5,8 S – ITS2 được A.oryzae T6 cho khả năng sinh tổng hợp chất AGIs cao.
2. Xác định được điều kiện thích hợp đối với sinh trưởng của A.oryzae T6 là môi trường rắn có tỷ lệ khối lượng cám gạo : gạo : trấu tương ứng là 40 : 40 : 20; độ ẩm là 55%; pH là 5,5; ở độ dày khối môi trường là 6 cm; tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 105 CFU/g và nhân giống ở nhiệt độ 30 ± 20C / 5 ngày (120 giờ).
3. Xác định được điều kiện thích hợp sinh tổng hợp AGIs bằng A.oryzae T6 ở điều kiện tối ưu là môi trường rắn có tỷ lệ khối lượng đỗ đen xanh lòng : cám gạo : K2HPO4 : KCL : MgSO4 tương ứng là 900 : 100 : 0,4 : 0,08 : 0,4; độ ẩm là 55%; pH ban đầu của môi trường là 5,5; độ dày khối môi trường là 6 cm; tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 106 CFU/g; ở nhiệt độ 30 ± 20C; thời gian lên men là 58 giờ.
4. Xác định được điều kiện thích hợp chiết xuất AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6: Tỷ lệ dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 là 6 lít / kg; ở 600C, thời gian 10 phút siêu âm với cường độ 8 W/cm2 (tần số 20 kHz, công suất siêu âm 3 kw/ giờ, dung tích 20 lít).
5. Xác định được điều kiện tinh sạch, định lượng AGIs và bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6: Tinh sạch sơ bộ AGIs từ chế phẩm AGIs thô bằng ethanol 90% cho hiệu suất thu hồi đạt 87,81% và độ tinh sạch tăng 50,216 %. Tinh sạch qua sắc ký lỏng hiệu năng cao – đảo pha (RP- HPLC) cho hiệu suất thu hồi đạt 57,92% và AGIs có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt IC50 là 8,12 µg/ml với độ tinh sạch tăng 99,99 %. Xác định được bản chất của chất kìm hãm α-glucosidase tinh sạch là peptide AGIs có khối lượng phân tử 926,4861 Da và xác định được lượng peptide AGIs trong đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 chiếm 0,183 %.
6. Bước đầu ứng dụng có hiệu quả chế phẩm AGIs sản xuất bột ăn liền cho người bệnh đái tháo đường và béo phì. Đây là kết quả bước đầu góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase để ngăn ngừa bệnh đái tháo đường và béo phì.
Kết quả luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về peptide có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase bằng phương pháp lên men rắn trên môi trường đậu đen xanh lòng nhờ Aspergillus oryzae (từ việc phân lập tuyển chọn Aspergillus oryzae, các điều kiện lên men, tách chiết, tinh sạch chất kìm hãm α-glucosidase, xác định bản chất của AGIs, tạo chế phẩm)
