TRANG THÔNG TIN VỀ LUẬN ÁN
– Tên luận án: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ các sản phẩm đậu nành lên men có khả năng sinh protease và thủy phân fibrin
– Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 62420201
– Họ tên nghiên cứu sinh: Lê Thị Ngọc Hân Khóa: 2016 đợt 2
– Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Thành
– Cơ sở đào tạo: Trường Đại Học Cần Thơ
1. Tóm tắt nội dung luận án
Đề tài này được thực hiện với mục đích phân lập và tuyển chọn được dòng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease và fibrinolytic enzyme có hoạt tính đặc hiệu cao từ sản phẩm đậu nành lên men, nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu dòng vi khuẩn được chọn sinh fibrinolytic enzyme hoạt tính cao, khảo sát các phương pháp thu nhận fibrinolytic enzyme thô phù hợp và nghiên cứu đặc điểm fibrinolytic enzyme sau tinh sạch. Kết quả phân lập được 115 dòng vi khuẩn từ các sản phẩm đậu nành lên men: chao, nước mắm chay, nước tương, tương hột ở các địa phương An Giang (24 dòng), Bến Tre (14 dòng), Cần Thơ (26 dòng), Đồng Tháp (12 dòng), Hậu Giang (14 dòng), Sóc Trăng (13 dòng), Vĩnh Long (12 dòng). Kết quả định danh sơ bộ dựa vào đặc điểm hình thái (tế bào và khuẩn lạc) và sinh hóa (nhuộm Gram, khả năng sinh bào tử, khả năng sinh catalase và kiểm tra methyl red) cho thấy các dòng này thuộc chi Bacillus. Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng phân giải protein trên môi trường SMA, kết quả kiểm tra khả năng sinh protease trên đĩa SMA đã tuyển chọn được 15 dòng có đường kính vòng halo lớn (từ 2,17-2,55 cm). Trong môi trường lên men lỏng với mật số 1,0×106 tế bào/mL; pH 7,2 ở 37 oC trong 48 giờ, chọn được dòng ML01 cho hoạt tính protease đặc hiệu cao 185,92 U/mg và hoạt tính fibrinolytic enzyme đặc hiệu cao nhất 92,23 FU/mg. Kết quả định danh theo phương pháp giải trình tự, trình tự dòng ML01 được giải gồm 1398 bps, cho thấy trình tự 16S rRNA của dòng ML01 có độ tương đồng 99,86 % so với trình tự gen 16S rRNA của Bacillus subtilis subsp. spizizenii (số đăng kí trên genbank là NR_112686.1). Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy Bacilus subtilis ML01 nhằm thu nhận fibrinolytic enzyme có hoạt tính cao. Thiết kế thí nghiệm Plackett- Burman được sử dụng để sàng lọc các yếu tố tối ưu nhất cho tổng hợp fibrinolytic enzyme. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ, carbon và khoáng được tuyển chọn làm các thành phần môi trường tối ưu. Trong đó, mười yếu tố bao gồm glucose, maltose, sucrose, soya peptone, yeast extract, K2HPO4 , MgSO4, CaCl2, pH và mật số tế bào được chọn để sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính trong môi trường lên men. Trong các yếu tố khảo sát, maltose, soya peptone, K2HPO4, mật số tế bào là 4 yếu tố tác động nhiều nhất (p<0,05). Các yếu tố này được tối ưu hóa bằng cách sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) phương án cấu trúc có tâm (CCD). Kết quả nhận được môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp fibrinolytic enzyme gồm glucose 18,15 g/L, soya peptone 9,59 g/L, K2HPO4 2,33 g/L và mật số vi khuẩn 2,6×106 tb/mL. Sau 48 giờ lên men cho hoạt tính fibrinolytic enzyme cao nhất 25,56 FU/mL cao hơn trước khi tối ưu 2,9 lần (8,89 FU/mL). Khảo sát các khoảng thời gian lên men, kết quả cho thấy dòng vi khuẩn Bacillus subtilis ML01 sinh tổng hợp fibrinolytic enzyme cho hoạt tính cao nhất là sau 48 giờ lên men. Tinh sạch sơ bộ enzyme từ dòng vi khuẩn Bacillus subtilis ML01 với ammonium sulfate (AS) ở nồng độ 80% bão hòa cho kết quả cao nhất so với các nồng độ nghiên cứu khác, trung bình tổng hoạt tính fibrinolytic enzyme (FE) là 72,22 U/mL và trung bình tổng hoạt tính đặc hiệu là 121,6 U/mg. Sau các công đoạn tinh sạch sắc ký trao đổi ion DEAE -cellulose và sắc ký lọc gel, kết quả cho thấy độ tăng hoạt tính tăng dần theo từng phân đoạn và sau sắc ký lọc gel G75 thì độ tăng hoạt tính của fibrinolytic enzyme gấp 4,1 lần so với mẫu enzyme thô ban đầu. Kết quả khảo sát đặc tính enzyme, thu nhận được fibrinolytic enzyme từ Bacillus subtilis ML01 thể hiện hoạt tính tiêu sợi huyết cao nhất ở pH 8. Độ bền hoạt tính của enzyme sau tinh sạch cũng tăng dần theo giá trị pH tăng, hoạt tính tương đối ổn định trong khoảng từ pH 7 đến 9. Khi tăng nhiệt độ từ 30 đến 37oC hoạt tính tương đối cho giá trị tăng lên và đạt cực đại ở 37oC (100%) sau đó hoạt tính enzyme giảm dần ở các mức nhiệt độ tăng dần, enzyme gần như đã mất hoàn toàn hoạt tính ở 70oC. Ảnh hưởng các ion kim loại và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme khác nhau, ion Cu2+ và Fe2+ làm tăng hoạt tính của enzyme ở cả 2 mức nồng độ 1mM và 5mM; chất ức chế PMSF ảnh hưởng mạnh nhất gây mất hoạt tính enzyme hoàn toàn ở cả 2 nồng độ, SDS cũng ảnh hưởng xấu đến hoạt tính enzyme, trong khi đó EDTA ảnh hưởng thấp hơn.
2. Những kết quả mới của luận án
Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về các dòng vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập từ các sản phẩm đậu nành lên men ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long có khả năng sản sinh enzyme protease và fibrinolytic enzyme làm tan huyết khối. Kết quả phân lập được 115 dòng vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng sinh enzyme protease, trong đó tuyển chọn được dòng vi khuẩn ML01 có khả năng sinh fibrinolytic enzyme phân giải huyết khối cao (hoạt tính đặc hiệu cao). Dòng vi khuẩn ML01 có độ tương đồng 99,86% so với trình tự gen 16S rRNA của Bacillus subtilis subsp. spizizenii (số đăng kí trên genbank là NR_112686.1). Tối ưu hóa điều kiện môi trường nuôi cấy dòng vi khuẩn ML01 để thu fibrinolytic enzyme có hoạt tính cao. Tinh sạch và khảo sát được đặc điểm của fibrinolytic enzyme từ dòng vi khuẩn ML01. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về sản xuất và ứng dụng enzyme protease từ các dòng vi khuẩn phân lập, đặc biệt fibrinolytic enzyme từ vi khuẩn Bacillus subtilis ML01 để làm tan huyết khối trong phòng và điều trị bệnh tim mạch.
3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu
Nhóm enzyme protease là nhóm có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, xử lý chất thải. Fibrinolytic enzyme (enzyme phân hủy huyết khối) thuộc nhóm protease có khả năng phòng ngừa và điều trị bệnh tim mạch, đột quỵ do huyết khối gây ra. Fibrinolytic enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn, nhưng chủ yếu từ vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập từ các sản phẩm đậu nành lên men, nguồn nguyên liệu rẻ tiền, an toàn và hiệu quả. Kết quả nghiên cứu bổ sung thêm dẫn liệu khoa học về vi khuẩn Bacillus spp. và khả năng sinh protease và fibrinolytic enzyme. Đây là hướng nghiên cứu mới sử dụng dòng vi khuẩn bản địa cho các nghiên cứu về protease và fibrinolytic enzyme, là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng sau này.
